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Autismo

Genetica Molecolare
Autismo
 

Elenco dei geni investigati e delle varianti genetiche studiate

 

Gene analizzato

Varianti genetiche studiate

NOS3

-786 T>C

Glu298Asp

VNTR introne 4

CBS

Y233Y (C699T )

T1080C (A360A)

SUOX

Q364X

S370S

S370Y

Cod.381del TAGA

MTHFR

A222V (C677T )

E429A (A1298C)

MTR

A2756G

MTRR

A66G

VDR

Fok1 (ATG ®ACG codon 1)

BsmI (A-G introne 8)

TaqI (T-C esone 9)

COMT

V158M

A72S

H62H

L136L

MAO A

R297R

MAO A

Q296X

SHMT

C1420T

 

Ossido sintetasi endoteliale (eNOS): polimorfismi -786 T>C, Glu298Asp e VNTR introne 4

 

L’enzima Nos ha un ruolo importante nella detossificazione dell’ammoniaca  nel ciclo dell’urea. Individui che presentano la mutazione NOS++ presentano attività ridotta di questo enzima.

Mutazioni di questo gene possono potenziare l’effetto dell’ attività del CBS dovuta all’incremento dell’ammoniaca prodotta .

Nel sistema vascolare, l’ossido nitrico (NO) esercita un ruolo importante producendo vasodilatazione, regolando il flusso sanguigno e la pressione arteriosa, e conferendo tromboresistenza e proprietà protettive all’endotelio dei vasi sanguigni. La vasodilatazione endotelio-dipendente è mediata dal rilascio di NO prodotto dall’ossido sintetasi endoteliale (eNOS). Una ridotta sintesi di NO o nella sua minore bio-disponibilità potrebbe essere la causa della ridotta vasodilatazione endotelio-dipendente che si osserva nei vasi sanguigni di soggetti fattori di rischio cardiovascolari, quali fumatori attivi e passivi, pazienti con ipertensione o ipercolesterolemia. La mancanza di effetti NO-mediati può inoltre predisporre allo sviluppo di arteriosclerosi. Il polimorfismo -786 T>C della regione promotore del gene codificante ossido sintetasi endoteliale (NOS3) riduce la sintesi di NO endoteliale, suggerendo che i portatori di tale variazione nucleotidica sono predisposti all’insorgenza di patologie coronariche. Ma l’indicazione più importante è data dal fatto che questa riduzione è esacerbata dal fumo di sigaretta.

La variante missense Glu298Asp, presente a livello dell’esone 7 del gene NOS3, agirebbe in sinergia con il polimorfismo della regione promotore, aumentando ulteriormente il rischio di patologie coronariche.

Un raro polimorfismo VNTR localizzato a livello dell’introne 4 del gene NOS3 (Ins>Del Introne 4) rappresenta un fattore di rischio di infarto al miocardio (MI). La frequenza di questa variante si è mostrata significativamente più elevata (di circa 7 volte) in pazienti con MI senza conosciuti fattori di rischio secondari. Questa variante è stata inoltre associata con stenosi arteriosa, specialmente in associazione con il tradizionale fattore di rischio del fumo di sigaretta. Yoshimura (1998) Hum Genet 103, 65; Nakayama (1999) Circulation 99, 2864; Wang (1996) Nat Med;2:41-45.  

 

Cistationina Beta Sintetasi (CBS): polimorfismi C699T e T1080C

 

La CBS  è un enzima necessario  per convertire l’Omocisteina in Cistatione, agisce fondamentalmente come ponte tra l’aminoacido di partenza e il passaggio successivo del ciclo di metilazione che genera ammoniaca. Le mutazioni investigate determinano una alterazione che impedisce al  “ponte”  CBS di richiudersi; questa stato sbilanciato toglie gruppi metilici al resto del ciclo  provocando carenze importanti tra cui quella di vitamina B12. Sebbene in questa situazione si producano elementi utili quali  il glutatione e la taurina,vi sono però dei prodotti di scarto negativi come l’ammoniaca e i solfiti. A causa dell’aumentata attività CBS,questi gruppi sulfurei necessari al ciclo della metilazione vengono rilasciati nel sistema sotto forma di solfiti che sono tossici per l’organismo e determina un deterioramento dei prodotti del SUOX; E’ stato dimostrato che i due polimorfismi del gene CBS (C699T e T1080C) determinano un aumento dell’attività dell’enzima, riducendo la quantità di omocisteina nel sangue. Tali polimorfismi sono inoltre associati ad  un rischio ridotto di insorgenza di patologie coronariche.

Individui con attività carente del CBS,alti livelli di turina e bassi livelli di glutatione,diminuiscono l’escrezione di metalli se assumono alti dosaggi di ALA (acido alfa lipoico ),non ne  è consigliata quindi in questi individui la supplementazione.

Alimenti ricchi di zolfo andrebbero evitati in caso di SUOX e CBS alterati.

 

SUOX   (Solfito Ossidasi) polimorfismi Q364X, S370S, S370Y e Cod.381del TAGA

 

Il  gene SUOX  è coinvolto nella attività di detossificazione dei  solfiti nel nostro organismo;

La solfito ossidasi è l’enzima terminale prodotto da questo gene nel processo di degradazione ossidativa degli aminoacidi contenenti Zolfo.

Sono state isolate quattro mutazioni del gene SUOX nelle linee cellulari di pazienti con insufficienza enzimatica di solfito ossidasi ( Kisker et al,1997 606887.0001-606887.0004).

Il molibdeno contenuto nella solfito ossidasi catalizza la conversione del solfito in solfato,il passaggio finale nella degradazione ossidativa di cisteina e metionina. Negli esseri umani l’insufficienza di questo enzima in genere conduce  ad anomalie neurologiche.

Delle quattro varianti identificate ed associate a insufficienza enzimatica  due sono legate al sito del solfato mentre le altre si trovano nel dominio che ne media la dimerizzazione (PMID:8719749).

L’insufficienza da solfito ossidasi neonatale è caratterizzata da gravi  disfunzioni neurologiche,atrofia del cervello,dislocazione del cristallino,incremento nelle urine di solfiti,tiosolfato,taurina e S-cisteina,e una bassa concentrazione di cisteina nel plasma.

Mutazioni nel  gene Suox,compromettono seriamente l’ attività detossificante,creando intolleranze spesso con esiti gravi.

 I solfiti sono generati come sottoprodotti naturali del ciclo di metilazione dagli alimenti che ingeriamo o dalle sostanze che possiamo inalare; vengono infatti utilizzati in grande quantità come conservanti per evitare lo scolorimento o impedire la crescita dei microorganismi nell’industria alimentare ( frutta ,verdura, marmellate,cibi precotti, ,pesce,farine,vino ecc) ; sono impiegati per    mantenere  la stabilità e la l’efficacia di alcune medicine,per prevenire la ruggine e le incrostazioni  nell’acqua delle caldaie e persino per la produzione del cellophane per  confezionare gli alimenti.

La Food and Drug Administration stima che  una  persona  su cento  è sensibile  ai solfiti  ed il 5 per cento di questi soffre d’asma. Una persona  può sviluppare sensibilità ai solfiti in qualsiasi momento della sua vita; gli scienziati non hanno evidenziato la  concentrazione minima di solfiti necessaria per scatenare  una reazione nelle persone sensibili. Il sintomo più comune riportato dalle persone intolleranti è la difficoltà di respirazione,ma i sintomi possono variare molto da persona a persona;i solfiti possono essere causa di orticaria,nausea,dolore al petto, ed in alcuni casi di  gravi reazioni allergiche. I solfiti inoltre  emanano un gas, l’anidride solforosa che causa  irritazione nei polmoni e può portare  a severi attacchi di asma. Mutazioni del SUOX possono essere cause di rischio per alcuni tipi di cancro,compreso la leucemia.I solfiti potrebbero stimolare la risposta adrenergica di “Attacco- Fuga” del sistema nervono autonomo e stimolare la risposta allo stress del cortisolo.

 Molte persone con mutazione SUOX+-,soffrono di reflusso acido che sembra nonrispondere ai normali farmaci antireflusso GER,è possibile chela radice del problema sia l’eccesso dei solfiti che producono effeti allergici simil-asma e che hanno come reazione secondaria il reflusso acido.

Soprattutto se associato ad una iperattività dell'enzima prodotto dal CBS (in caso di etero o omozigosi) è necessario ridurre l'apporto dietetico dei cibi e supplementi contenenti zolfo come la metionina, taurina e cisteina, che sono soprattutto concentrate nelle proteine animali (e che quindi conviene ridurre nell'alimentazione.)

Molti integratori come il GSH, MSM, NAC dovrebbero essere evitati,così come  alcuni farmaci utilizzati come antipertensivi o antibiotici o chelanti dovrebbero essere utilizzati con attenzione.

I solfiti  pertanto  risultano essere   neurotossici e possono accumularsi in caso di difettoso funzionamento del SUOX nella sua forma di eterozigote o di omozigote. Per accelerare il funzionamento del SOUX è consigliabile  la supplementazione con Molibdeno, Boro, Vitamina E e  VitaminaB12.

 

MTHFR (Metilentetraidrofolatoreduttasi): polimorfismi C677T e A1298C

 

La metilentetraidrofolatoreduttasi (MTHFR) è un enzima coinvolto nella trasformazione del 5-10 metilentetraidrofolato in 5 metiltetraidrofolato che serve come donatore di metili per la rimetilazione della omocisteina a metionina tramite l'intervento della vitamina B12. E’ un punto focale del ciclo della metilazione e riveste  inoltre un ruolo fondamentale  sui livelli dei neurotrasmettitori serotonina e dopamina.

Rare mutazioni ( trasmesse con modalità autosomica recessiva) possono causare la deficienza grave di MTHFR con attività enzimatica inferiore al 20% e comparsa di omocisteinemia ed omocistinuria e bassi livelli plasmatici di acido folico. La sintomatologia clinica è grave con ritardo dello sviluppo psico-motorio e massivi fenomeni trombotici.

Accanto alla deficienza grave di MTHFR è stato identificato un polimorfismo genetico comune, dovuto alla sostituzione di una C (citosina) in T (timina) al nucleotide 677 (C677T), che causa una sostituzione di una alanina in valina nella proteina finale ed una riduzione dell'attività enzimatica della MTHFR pari al 50% ,fino al 30% in condizioni di esposizione al calore (variante termolabile).Tale variante comporta livelli elevati nel sangue di omocisteina specie dopo carico orale di metionina. La frequenza genica in Europa della mutazione è del 3-3,7% che comporta una condizione di eterozigosi in circa il 42-46% della popolazione e di omozigosi pari al 12-13%. Recentemente, una seconda mutazione del gene MTHFR (A1298C) è stata associata ad una ridotta attività enzimatica (circa il 60% singolarmente; circa il 40% se presente in associazione alla mutazione C677T). Questa mutazione, in pazienti portatori della mutazione C677T, determina un'aumento dei livelli ematici di omocisteina.

Livelli aumentati di omocisteina nel sangue sono oggi considerati fattore di rischio per malattia vascolare, (trombosi arteriosa) forse attraverso un meccanismo mediato dai gruppi sulfidrilici sulla parete endoteliale dei vasi. Inoltre in condizioni di carenza alimentare di acido folico la variante termolabile della MTHFR porta a livelli molto bassi l'acido folico nel plasma ed è pertanto un fattore di rischio per i difetti del tubo neurale nelle donne in gravidanza. Condizioni di eterozigosi doppia, specie con la variante Leiden del fattore V comporta o della variante 20210 della protrombina, può aumentare il rischio relativo per il tromboembolismo venoso, già alto per la presenza dell'altra variante. Frosst et al. (1995) Nature Genet. 10: 111-113; Van der Put et al. (1998) Am. J. Hum. Genet. 62: 1044-1051.

 

Metionina sintetasi gene (MTR): polimorfismo A2756G

 

Il gene MTR codifica per un enzima che è coinvolto nella conversione dell’omocisteina in metionina. Il polimorfismo A2756G aumenta l’attività di questo enzima, incidendo sui livelli ematici di folato ed omocisteina Ridotti livelli di omocisteina riducono il rischio di insorgenza di patologie cardiovascolari..

Mutazioni in MTR possono aumentare l’attività dei prodotti  dei geni COMT e VDR Bsm/Taq,determinando un aumentato fabbisogno di B12,poiché l’enzima ne utilizza molto.

E’ stato dimostrato che la presenza del polimorfismo A2756G determina una diminuzione delle probabilità di difetti del tubo neurale durante la gravidanza ed un rischio diminuito di trombosi venosa. Leclerc (1966) Hum. Molec. Genet. 5: 1867-1874

 

Metionina sintetasi reduttasi (MS_MTRR): polimorfismo A66G

 

La Metionina sintetasi reduttasi è un enzima necessario per la formazione di un derivato della vitamina B12. Tale enzima è indispensabile per mantenere un adeguata quantità di vitamina B12 cellulare, di metionina  e  di folato, e per mantenere bassi i livelli di omocisteina.L’MTRR fa parte della grande famiglia di enzimi  conosciuti come diflavin-osidoreduttasi.L’attività del MTRR può quindi essere  svolta da un altro enzima di questa famiglia il citocromo P-450-reduttasi.gli enzimi di questa famiglia hanno struttura simile. in essi sono presenti l’MTRR, il P450-reduttasi,l’emossigenasi ,l’ossido nitrico-sintetasi ,l’NR1-reduttasi.

L’indol-3-carbinol favorisce la formazione di citocromo ”“P-450-reduttasi.

Grazie a questa capacità di sostituire la funzione del MTRR,l’utilizzo di indil-3 carbinol può essere utile in caso di mutazione MTRR.

L’acido alfa lipoico (ALA) può invece ridurre l’azione del citocromo ”“P450,reduttasi,quindi si deve considerare una riduzione di ALA, per coloro che hanno una  mutazione MTRR.

 

I geni MTR E MTRR ,lavorano insieme per rigenerare  e utilizzare la vitamina B12,nel ciclo della metilazione,aiutando a convertire l’omocisteina in metionina. Persone che presentano mutazioni di questi geni  dovrebbero aumentare l’utilizzo di vitamina B12

Il polimorfismo A66G è associato con un aumento del rischio di malattie cardiovascolari, indipendenti dai livelli di omocisteina. E’ stato inoltre dimostrato che tale polimorfismo aumenti il rischio di difetti del tubo neurale, spina bifida e sindrome di Down durante la gravidanza.

Brown (2000) J Cardiovasc Risk 7, 197.

 

Recettore della Vitamina D (VDR): polimorfismi Fok1, e TaqI  

 

I recettori della vitamina D  sono polipeptidi  intracellulari che interagiscono con i nuclei delle cellule target per produrre una serie di effetti biologici. La Vitamina D promuove l’assorbimento intestinale e renale del calcio ed è indispensabile per lo sviluppo ed il mantenimento della massa ossea. La vitamina D è anche coinvolta nei processi di controllo della proliferazione e della differenziazione cellulare, nonchè nella immuno-modulazione. Nel sistema immunitario, ad esempio, la vitamina D promuove la differenziazione dei monociti ed inibisce la proliferazione dei linfociti attraverso l’increzione di citochine come IL-2 , l’IL12 e l’ interferon ”“γ. In alcuni tipi di cellule di carcinoma, la vitamina D ha dimostrato un’attività antiproliferativa.

Gli effetti della Vitamina D sono mediati dal suo recettore nucleare (VDR); questo è strettamente correlato ai recettori steroidei ma soprattutto a quelli degli ormoni tiroidei; È ormai ampiamente dimostrato inoltre  un coinvolgimento funzionale degli alleli del VDR nell’omeostasi del calcio e nella mineralizzazione dell’osso. Gli studi iniziali hanno consentito di riscontrare l’interazione tra il gene del VDR, l’assorbimento di calcio e i livelli di calcio nella dieta. Le variazioni alleliche del gene VDR spiegano per il 70% gli effetti genetici sulla densità ossea. Vengono qui presi in considerazione tre polimorfismi (Fok1, Taq,I BsmI):

 

Il polimorfismo Fok1

Fok1(consiste in una sostituzione nucleotidica T-C a livello del codone di inizio della traduzione del gene VDR (ATG®ACG). Tale polimorfismo determina la traslazione di tre aminoacidi dal sito d'inizio della traduzione del gene con conseguente alterazione della relativa proteina, mancante di tre aminoacidi. Il nucleotide T viene anche definito allele f, mentre il nucleotide C viene definito allele F. La combinazioni di questi alleli può produrre i genotipi ff (TT), Ff (CT) e FF (CC). ) Mutazioni  del Fok sono correlate al controllo della concentrazione dello zucchero nel sangue,in caso di mutazione è consigliabile prestare attenzione a supportare il pancreas  per mantenere i livelli di zucchero nel sangue nella norma.

In letteratura sono noti alcuni lavori che correlano l’associazione del polimorfismo VDR Fok1 con il genotipo FF, con il rischio di sviluppo del carcinoma del colon, in rapporto all’apporto di calcio e grasso nell’alimentazione. In particolare, è stato evidenziato come, sebbene il calcio o il grasso alimentari non correlano normalmente con il rischio di sviluppo di carcinoma del colon nei soggetti con genotipo FF, in quelli con genotipo a combinazione allelica multipla ff/Ff, un diminuito apporto del calcio o del grasso nell’alimentazione aumenterebbe tale rischio. Per individui con genotipo ff e dieta povera di grasso e calcio, il rischio di sviluppo del carcinoma del colon era di circa 2.5 volte maggiore rispetto agli altri. Morrison et al. (1994) 367(6460):284-7. Arai (1997) J Bone Miner Res 12, 915.

 

 Il polimorfismo TaqI

(localizzato nell’esone 9 del gene VDR, a livello del codone 352, consiste in una variazione nucleotidica T-C. . Il nucleotide T viene anche definito allele T, mentre il nucleotide C viene definito allele t.

La combinazioni di questi alleli può produrre i genotipi TT (TT), Tt (TC) e tt (CC).)

Mutazioni del  Taq possono influenzare i livelli di dopamina.

E’ importante per questa ragione guardare complessivamente allo stato del COMT e del Vdr/Taq e suggerire integratori o supplementi nella dieta in base ai risultati dei due siti..

 

Il polimorfismo BsmI,

localizzato nell’introne 8 del gene VDR e consistente in una variazione nucleotidica A-G, è associato invece alla variazione della stabilità del trascritto e ad una diminuzione dei valore della BMD. Il nucleotide A viene anche definito allele B, mentre il nucleotide G viene definito allele b. La combinazioni di questi alleli puo produrre i genotipi BB (AA), Bb (AG) e bb (GG). I valori di densità più elevati sono risultati a carico dell’allele b, mentre il meno frequente allele B è risultato associato con valori di BMD inferiori. Quindi il genotipo BB predisporrebbe ad un basso livello di massa ossea. Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato che il genotipo BB predispone ad un ridotto assorbimento di calcio a livello intestinale.

 

COMT (Catecolo-O-metiltransferasi): polimorfismi V158M A72S H62H L136L

 

Il COMT è un importante mediatore del metabolismo delle catecolamine nonchè un modulatore dei pathway adrenergici e dopaminergici compresi quelli coinvolti nella trasmissione del dolore.

La funzione primaria del gene COMT (Catecolo-O-metiltransferasi)  è quella di favorire la  degradazione della dopamina, nonché  quella delle epinefrine e norepinefrine modulando la risposta dei  farmaci utilizzati nel trattamento dell’ipertensione,dell’asma e nella terapia per il Parkinson. La dopamina aiuta  a generare le sensazioni piacevoli che rinforzano i  comportamenti  positivi  e  motivando la persona ad agire in determinati modi per ottenere ricompensa. Il COMT  è anche coinvolto nel metabolismo degli estrogeni. Recentemente la sensibilità al dolore è stata correlata all’attività del COMT, gli  individui omozigoti COMT++,possono essere più sensibili al dolore. Un frequente polimorfismo di questo gene è il V158M, che contribuisce alla regolazione della funzionalità del recettore degli oppioidi ; lo stesso è stato inoltre associato ad una diminuzione della funzionalità dell’enzima di tre-quattro volte (Zubieta et al., 2003). E’ stato osservato che pazienti affetti da dolore cronico conseguente a neoplasia con la variante V158M, necessitavano di una dose inferiore di morfina rispetto ai pazienti “wild-type” (Rakvag et al., 2005). Sembra che la ridotta funzionalità enzimatica induca una ridotta degradazione della dopamina con conseguente deplezione della encefalina. Per effetto compensatorio l’espressione del recettore degli oppioidi viene aumentata (Zubieta et al., 2003)

 

MAO (Monoaminossidasi)-MAOA

 

Il gene MAOA , localizzato nel cromosoma X , metabolizza le amine tra cui la dopamina,la norepinefrina e in particolar modo  la serotonina, un neurotrasmettitore sintetizzato nei neuroni serotoninergici del sistema nervoso centrale,e strettamente implicato nella fisiologia delle emozioni.

Il MAOA è  stato associato in numerosi studi  alla depressione,all’aggressività, all’ansia ed ai disturbi OCD  ( ossessivo-compulsivi ); ha un ruolo fondamentale nei disturbi da panico,in quanto  nella cura  vengono utilizzati efficacemente gli inibitori della monoaminoossidasi .L'interesse verso questi polimorfismi è stato ulteriormente accresciuto dalla dimostrazione che non tanto la loro espressione, quanto la combinazione tra essi e fattori ambientali si dimostrava particolarmente significativa. Altri approcci basati sulla complementarietà suggeriscono un ruolo del poliformismo MAOA nella regione promoter, nei rischi della Sindrome di iperattività di disturbo di concentrazione (ADHD) PMID.12140786.

E’ stato inoltre riscontrato un nuovo polimorfismo nel  promotore del gene MAOA,associato  ai disordini da panico in due casi distinti:in Germania su  80 pazienti,e in Italia su 129 pazienti. Due alleli ( 3 e4 repeat) sono i più  comuni e costituiscono  più del 97% degli alleli osservati.(Deckert et all 1999).

 

SHMT  (Serinaidrossimetiltrasferasi) C1420T

 

Il gene SHMT interviene nel ciclo di metilazione durante il trasporto dei blocchi necessari per la sintesi di nuovo DNA,e nel processo di sintesi dell’omocisteina. Mutazioni nell’SHMT  possono così influenzare la capacità di regolare i prodotti di questo gene e interferire con il delicato bilanciamento del ciclo di metilazione,causando accumulo di omocisteina e di altre sostanze intermediarie nell’organismo.

L’ enzima SHMT contenente il fosfato piridossale,catalizza la conversione reversibile della serina e del teidrafolato a glicina e a 5,10 metilentetraidrofolato. Alcune cellule eucariote,incluse le cellule umane,contengono entrambe le forme di SHMT,,mitocondriale e citosolico,è stato ipotizzato che la sintesi della glicina a partire dalla serina avviene nei mitocondri,mentre l’SHMT citosolico può catalizzare  la conversione di glicina in serina.(Garrow et alt.1993)

Il metabolismo dei folati è un punto critico per la sintesi di numerosi costituenti cellulari richiesti per la crescita cellulare e l’SHMT è un punto focale di questo processo.

E’stata dimostrata una associazione tra  i polimorfismi dell’MTHFR C677T e dell’SHMT C1420T e il rischio di ESCC o carcinoma squamoso esofageo e la sindrome GCA.

 

DESCRIZIONE TECNICA DELL'ANALISI 

 

Il test molecolare di viene condotto effettuando l'analisi dei polimorfismi descritti in tabella 1. Per la genotipizzazione dei citati polimorfismi si opera inizialmente una reazione enzimatica di amplificazione del DNA, conosciuta come Polymerase Chain Reaction (PCR), che consente di amplificare in vitro una specifica regione della molecola, copiandola in varie fasi successive, fino ad ottenerne milioni di copie. Successivamente i prodotti di PCR così ottenuti vengono sottoposti ad analisi di sequenza automatizzata mediante l'impiego di un sequenziatore automatico a tecnologia fluorescente (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer). L'analisi di mutazione viene effettuata mediante analisi comparativa tra le sequenza ottenute per il campione in esame e le sequenze normali dei geni investigati, depositate nel database internazionale GeneBank.

 
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