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Helicobacter Pylori - Analisi qualitativa

Infettivologia Molecolare
Helicobacter Pylori - Analisi qualitativa
Diagnosi molecolare delle infezioni da Helicobacter Pylori mediante amplificazione genica (PCR)
 

Classificazione ed Eziologia: 

Batterio microaerofilo gram (-), munito di 4-6 flagelli, ricurvo o spiraliforme, fu isolato per la prima volta da Marshall e Goodwin nel 1987 dalla mucosa gastrica dei primati. E' lungo circa 3 mm e largo 0.5 mm, possiede un glicocalice (mucopolisaccaride) importante mediatore nel fenomeno di adesione alla mucosa gastrica. Habitat naturale dell'HP è l'epitelio di tipo mucoide gastrico, potendo esso localizzarsi sia a livello dello stomaco che in aree di metaplasia gastrica duodenali o esofagee. Il batterio si insinua, in virtù della presenza di enzimi lipolitici e proteolitici, con movimento "a cavaturacciolo", dentro lo strato mucoso gastrico dal quale risulta protetto dall'acido, anche per la costituzione entro il muco di nicchie ecologiche ad alto pH legate alla formazione di ioni ammonio attraverso una fortissima attività ureasica sull'urea ambientale. 

Epidemiologia: 

L'HP si manifesta a carattere endemico in tutto il mondo. Circa il 100% dei pazienti con ulcera duodenale sono infettati dall'HP; più del 70% dei pazienti affetti da ulcera gastrica hanno l'HP; inoltre lo si ritrova nel 50-60% dei soggetti dispeptici. Quando si esaminano soggetti asintomatici, ogni volta che l'H. Pylori è messo in evidenza , si osserva di fatto una gastrite istologica. La prevalenza di l'H. Pylori in questi soggetti aumenta con l'età: l'H. Pylori viene trovato nel 10% dei soggetti di età compresa tra i 20-30 anni e in circa il 50% delle persone di età compresa tra i 60-70 anni. La ricerca dell'HP è il più delle volte positiva a livello dell'antro, può anche essere messo in evidenza ovunque esista una metaplasia (esofago, fondo dello stomaco e duodeno). L'infezione da HP è stata associata con lo sviluppo del linfoma gastrico non-Hodkin e con altri disordini linfoproliferativi quali il MALT (Tessuto Linfoide Associato alla Mucosa gastrica) ed il linfoma (MALToma ). Nel 92% dei campioni ottenuti da pazienti con linfoma gastrico, è stata accertata la presenza di HP. 

Infezione da fonte animale e ambientale: 

Isolato in molti animali come maiali e gatti, suggerisce l'esistenza di un serbatoio animale con trasmissione dall'animale all'uomo. L'acquisizione dell'infezione attraverso l'acqua proveniente dall'acquedotto, o mediante il consumo di vegetali non cotti sottolinea l'importanza della fonte ambientale; 

Diffusione della malattia: 

La diffusione diretta interumana dell'infezione da HP può essere oro-orale e oro-fecale. La diffusione oro-orale è rappresentata dal costante turnover della mucosa gastrica e dalla presenza in essa dell'HP; il reflusso gastrico può raggiungere la cavità orale ed in particolare la placca dentaria e da qui con la saliva essere il veicolo di trasmissione. La diffusione oro-fecale è sostenuta dal continuo turnover della mucosa gastrica; la ripetuta eliminazione nell'intestino dell'HP proveniente dal succo gastrico e la capacità di sopravvivenza dell'HP nelle feci, da dove è eliminato nell'ambiente, rende l'acqua e il cibo contaminabile dall'HP. 

Eterogeneità genetica: 

L'eterogeneità genetica viene mantenuta dai seguenti fenomeni: - mutazioni puntiformi nei geni conservati (es. gene dell'ureasi); - diversità nell'ordine con cui i geni si associano nel genoma dell'HP; - mosaicismo di alcuni geni conservati (es. vacA); - presenza di cluster di geni non conservati (es. geni dell'isola cag); - esistenza di sequenze di inserzione ed elementi genetici trasponibili; Patogenicità: 1) Gene CagA è presente nel 60% dei ceppi e rappresenta il primo gene non conservato; esprime una proteina di superficie di circa 130 kDa, considerata tra i principali immunodominanti del batterio; gli anticorpi anti proteina cag A gene sono presenti nel 100% dei sieri di pazienti infetti da HP che manifestano l'ulcera peptica e solo nel 62% dei pazienti sofferenti di gastrite; la proteina è associata a comparsa di ulcera duodenale, gastrite cronica atrofica, adenocarcinoma gastrico; stimola la produzione di IL8, importante fattore chemiotattico per i linfociti impegnati nell'evoluzione del processo infiammatorio; 2) Gene VacA codifica una citotossina di 87 kDa; la citossina altera in normale traffico di vescicole del compartimento endosomiale profondo che, fondendosi tra loro, formano le caratteristiche vacuolizzazioni; l'ammoniaca prodotta dall'attività ureasica dell'HP diffonde negli endosomi, all'interno dei quali, protonandosi, vi rimane sequestrata; 

Citotossicità: 

Tipo I : ceppo citotossico caratterizzato dalla presenza del gene cagA; 

Tipo II: ceppo non cititossico caratterizzato dalla mancanza del gene cagA; 

Sottotipi di fenotipo intermedio

- gruppo a: ceppi non citotossici che esprimono la proteina CagA; 

- gruppo b: ceppi citotossici, di genotipo cagA positivo, ma che non esprimono la corrispondente proteina; 

- gruppo c: ceppi non citotossici, di genotipo cagA positivo, ma che non esprimono la corrispondente proteina;

- gruppo d: ceppi citotossici privi del gene cagA. 

Meccanismo di danno tissutale: 

- 1. ADESIVITA': Capacità di adesione all'epitelio gastrico. 

- 2. ENDOCITOSI: La penetrazione dell'H. pylori nelle cellule del- l'epitelio gastrico è fattore di lesione e rende dif- ficile l'eradicazione con chemioterapici. 

- 3. ATTIVITA' UREASICA: Istolesività causata da liberazione di NH4+. 

- 4. ENZIMI ISTOLESIVI: Modificazione del muco superficiale a causa di lipasi, fosfolipasi e proteasi. 

- 5. FLAGELLI: Ruolo ancora da definire. 

- 6. CITOTOSSINA:La virulenza varia a seconda della capacità di espri- mere e produrre la tossina vacuolizzante (VacA) e la proteina associata (CagA). 

Prelievo 

Con la tecnica di PCR è possibile effettuare l'esame direttamente da materiale fecale, placca dentaria e saliva. Attualmente, considerando che l'esame viene eseguito mediante la tecnica di amplificazione del DNA batterico relativo ai geni cagA e ureC, è l'unico test non invasivo che permette una sicura diagnosi. 

Aspetti clinici 

Non esiste una sintomatologia specifica; l'aspetto clinico è quello di una sindrome dispeptica. Talvolta, il quadro clinico è dominato da una sintomatologia ulcerosa duodenale; in circa il 50% dei casi la gastrite è asintomatica, non di meno l'allarme può essere dato da una sensazione di fame mattutina con dolore e da alitosi. Indicazioni alla terapia eradicante e valutazione della terapia La riduzione del tasso di recidiva ulcerosa dopo eliminazione del germe, dimostrata in numerosi studi, è un elemento a favore del trattamento. Nel 1997, l'European Helicobacter Pylori Study Group (EHPSG) ha sviluppato alcune linee-guida europee sulla base delle ultime cognizioni scientifiche e su come tali notizie debbano tradursi, sia a livello clinico che metodologico strumentale, all'eradicazione dell'HP in tutti i pazienti infettati. L'eradicazione è fortemente raccomandata in tutti i pazienti infettati con diagnosi di ulcera duodenale o gastrica, pregressa o attuale, inclusi quelli in remissione che ricevono trattamenti di mantenimento con antisecretori. La raccomandazione all'eradicazione è estesa ai pazienti con ulcera peptica sanguinante, nei quali deve essere accertata l'eventuale infezione e la terapia eradicante deve essere somministrata dopo la fase di sanguinamento. La terapia eradicante è notevolmente raccomandata anche in quei pazienti con diagnosi di MALT-linfoma gastrico a basso grado, dopo accurata stadiazione. L'eradicazione è raccomandata anche in quei pazienti con forme di gastrite avanzata e progressivamente ingravescente, come quelli che presentano una gastrite cronica atrofica severa con o senza metaplasia intestinale. Sebbene i dati presenti in letteratura non siano univoci, l'eradicazione è ulteriormente raccomandata a quei pazienti con dispepsia funzionale, previa esclusione di altre possibili cause dei sintomi presentati. In vitro, l'HP è sensibile a numerosi antibiotici della classe delle penicilline, e macrolidi; alcune cefalosporine sono efficaci, mentre gli aminoglicosidi risultano inefficaci, come pure la vancomicina, il trimetoprim, il cotrimossazolo. Alcuni ceppi di HP sono resistenti anche al metronidazolo. Il trattamento, quando è giustificato, consiste attualmente in una tripla terapia associata, cioè la somministrazione di un inibitore della pompa protonica (PPI) con altri due antibiotici a scelta, tutti per una settimana. Il controllo dell'efficacia della terapia si può effettuare anche un mese dopo la fine del trattamento da materiale fecale con la PCR. Il successo di una terapia mirata all'eradicazione dell'HP può essere rivalutato ulteriormente dopo 2-4 mesi. Strategie diagnostiche per l'Helicobacter pylori Le strategie diagnostiche per l'identificazione di HP sono state sviluppate seguendo due schemi di indagine. Il primo consiste nell'identificazione diretta dell'organismo ed è invasivo. Il secondo, non invasivo, consiste nell'identificazione degli anticorpi anti-HP. L'approccio invasivo richiede l'esecuzione di una biopsia a livello del tratto gastrointestinale. La presenza di Helicobacter Pylori viene quindi confermata mediante esame microscopico diretto o mediante coltura da campione bioptico. Questo metodo ha il vantaggio di valutare lo stato della mucosa dello stomaco e il grado dell'infezione attiva. Inoltre è altamente specifico ed ha un elevato valore predittivo positivo. Le difficoltà associate a questo approccio consistono in un certo rischio e disagio per il paziente. Inoltre l'HP tende a colonizzare a macchia e quindi può non essere identificato dal campione bioptico. La coltura dell'H. Pylori da campione bioptico è difficoltosa e richiede tempo. Queste difficoltà tecniche possono dare risultati falsi negativi. L'urea breath test (urea marcata con C13 o C14 è un metodo non invasivo che si basa sull'attività ureasica del batterio. Sebbene questo test sia altamente sensibile, ma meno specifico per la presenza di germi orali urea produttori non H. Pylori, ha però delle limitazioni, è costoso e richiede molto tempo nell'esecuzione, e necessita di una strumentazione specifica per la misurazione di C13 o C14. L'approccio non invasivo più comune per l'identificazione di HP è l'identificazione sierologica degli anticorpi specifici. Sebbene questo sia un approccio indiretto esiste una stretta correlazione tra gastrite, presenza di H. Pylori e sieropositività. Gli svantaggi dei test sierologici consistono nella difficoltà di interpretazione dei risultati e in una bassa specificità dovuta a cross-reazioni con altri organismi. Diagnosi dell'Infezione Una varietà di tests sono oggi disponibili per diagnosticare l'infezione da H. Pylori. Sia l'esame istologico del tessuto gastrico che la coltura batterica, il test dell'ureasi e l'uso di sonde di DNA, usate per valutare il tessuto gastrico, richiedono l'esame endoscopico; i pazienti che eseguono tali tecniche incorrono in spese e rischi, che sebbene lievi, spesso conducono a complicazioni dovute alla tecnica invasiva. Al contrario, il breath test, l'esame sierologico e la PCR sono tecniche non invasive che non richiedono l'indagine endoscopica. Considerazioni sulla scelta del test Oggi, alla luce di quanto illustrato, la scelta tra le diverse tecniche diagnostiche per l'HP deve essere effettuata tenendo presente tutto ciò che si è considerato e che deriva dalle attuali conoscenze. Per avere un rapido confronto metodologico, sono stati riassunti tutti i vantaggi e gli svantaggi delle tecniche di laboratorio attualmente in uso.

Riepilogo informazioni sull' esame:

Gene Investigato:  

 Amplificazione: Regione CagA-UreA del genoma del patogeno

Metodica Impiegata:  

 Amplificazione genica (PCR); rilevamento in gel di agarosio

Referto:  

 Report

Consenso informato:  

 Non necessario

Diagnosi Prenatale:  

 

  Tempi di risposta   Analisi Qualitativa: 4-7 gg  



Campioni biologici su cui è possibile eseguire il test:

Siero  

 2 ml

Liquido Amniotico  

 10 ml

  Villi Coriali

10 mg

 

Conservazione: i campioni possono essere conservati a 4°C per 24 ore o a -80°C per tempi più lunghi.

 
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